流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）自70年代發(fā)明之初便匯聚了計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學及細胞免疫學的智慧，是現代生物學研究中最重要的技術之一，與激光共聚焦和膜片鉗技術并稱“拉動現代生物科學研究的三駕馬車”。

       現代流式細胞術在單克隆抗體制備技術和定量熒光細胞化學不斷發(fā)展以及流式細胞儀研制革新的驅動下，以其高速客觀，能夠處理復雜樣本并同時獲取多種參數等諸多優(yōu)點，受到越來越多的生物醫(yī)學研究和藥物研發(fā)機構的推崇。

 

流式細胞術的雛形

 

     “流式細胞術”的概念是在1934年被提出來的。那一年Moldavan在《Science》上發(fā)表了一篇文章，首次提出了當懸浮的血細胞流過一個毛細管時，通過光電傳感器記錄的光信號可以實現“細胞計數”的想法。不過第一個將這個想法付諸實施的人卻是Gucker，他在1947年的《Journal of American Chemical Society》上介紹了一個裝置，可用于檢測氣溶膠中的微生物。該裝置通過鞘流將樣本引導到流動室中央，當細胞通過檢測區(qū)時使用光源進行照射，然后以光電管接收細胞產生的光信號。

         Gucker的裝置建成后，科學家們又開始嘗試將這個技術應用到細胞計數上。1953年，Crosland-Taylor在血細胞計數儀上使用了類似Gucker裝置的鞘流技術和光學系統(tǒng)，第一次完整實現了Moldavan的最初想法。很多產商非常看好這種計數儀，紛紛投入資源開發(fā)類似的分析設備。至上個世紀50年代末，相關方法學原理和應用都已成熟，流式細胞術初具雛形。

 

流式細胞儀的實驗室搭建

 

       20世紀60年代初，很多科學家開始嘗試利用細胞染色和顯微鏡圖像掃描技術進行白細胞分類，不過研究過程異常復雜和艱難。而此時，在IBM工作的Louis Kamentsky卻另辟蹊徑，搭建了一臺流式細胞儀原理樣機用于白細胞分類研究，并取名“Rapid Cell Spectrophotometer (RCS)”。這臺流式細胞儀采用顯微分光光度技術代替了原始的圖像掃描，采用樣本液流動傳送裝置取代了傳統(tǒng)的顯微鏡平臺，使得過去費時、復雜的細胞分類工作變得簡單、高效。1965年Kamentsky在《Science》上發(fā)表了他的研究成果，很多人也因此把他看做是建立流式細胞儀的第一人。

       Kamentsky的RCS還配備了一個注射泵分選裝置，同樣發(fā)表在1967年的《Science》上，不過遺憾的是，這篇文章卻不是首篇關于細胞分選的文章，在Los Alamos Scientific Laboratory的Mack Fulwyler走在了Kamentsky的前面，于1965年率先在《Science》上發(fā)表了第一篇基于Coulter原理和噴墨打印機技術的細胞分選的文章，他也因此被認為是“液滴分選之父”。
        Kamentsky共搭建了兩臺RCS，其中一臺借給了斯坦福大學的Leonard Herzenberg。在1969年的《Science》上， Herzenberg第一次發(fā)表了利用熒光染色技術對細胞進行分選的方法。在隨后的幾年，Herzenberg又在RCS基礎上對流式細胞儀進行了改進，搭建了用熒光觸發(fā)的流式細胞分選儀（Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS），并建立了將FACS與熒光單克隆抗體結合檢測細胞的技術。從此，流式細胞儀開始進入“熒光染色時代”。

 

區(qū)別一組概念：隨著時代的發(fā)展，FCM（流式細胞術）與FACS（熒光激發(fā)細胞分選實驗）所指代的具體實驗技術各有側重。

 

商品化流式細胞儀的出現

 

       盡管沒有像Kamentsky、Fulwyler和Herzenberg那樣在《Science》上發(fā)表過類似的“傳世佳作”， 德國科學家Wolfgang Göhde卻因1969年研制了世界上第一臺商品化的熒光流式細胞儀“Impulscytophotometer”（ICP-11）而“名留千古”。
       Kamentsky離開IBM后創(chuàng)建了一家公司Bio/Physics Systems，并于1970年推出了流式細胞儀Cytograf和Cytofluorograf。1972年在斯坦福大學，Herzenberg開發(fā)出FACS后，又與Becton-Dickinson（BD）公司合作，于1974年推出了BD的第一款商用流式細胞儀FACS-1。同期，Fulwyler也離開了他所工作的實驗室，加盟到Coulter公司旗下的Particle Technologies繼續(xù)研究流式細胞儀，后來在他和Robert Auer的帶領下Coulter公司也在1975年推出了自己的第一款商用產品TPS-1。

FACS-1與Herzenberg

 

從科研到臨床

 

      隨著單克隆抗體制備技術的廣泛應用，越來越多的血細胞分化決定簇（cluster of differentiation, CD）被發(fā)現。在研究這些CD在細胞分化和調控機制中的作用時，流式細胞儀起到了重要作用，從而促成了相關科研成果向醫(yī)學領域的快速轉化。
      CD4細胞計數就是一個利用流式細胞儀把科研轉化到臨床應用過程中具有代表性的例子。結合流式細胞儀和單克隆抗體，可以將T淋巴細胞劃分為CD4細胞和CD8細胞，而前者是人體免疫系統(tǒng)的“司令官”，指導著其它免疫細胞對抗病原微生物的侵襲。在AIDS發(fā)病機制的研究中發(fā)現，HIV入侵的靶細胞主要是CD4細胞，病毒感染細胞后會大量繁殖，直接溶解、破壞CD4細胞，致使AIDS患者常常表現為CD4細胞降低，因而CD4細胞計數成為了AIDS的診斷依據。CD4細胞在HIV/AIDS中重要作用的發(fā)現，使過去僅在科研中使用的流式細胞儀開始走入醫(yī)學診斷領域，并成為臨床上檢測CD4細胞的主要方法。
       科研人員用流式細胞儀在CD4細胞的研究和應用為臨床醫(yī)學應用打開了一扇窗，為人們展示了流式細胞儀的重要作用，也為臨床醫(yī)學帶來了巨大的變化。目前，通過流式細胞儀對淋巴細胞亞群（例如T、B、NK細胞）分析已成為臨床上評估免疫功能的主要方法，在免疫缺陷病、移植排斥反應、感染性疾病、自身免疫病、腫瘤、間質性肺疾病等的診斷、治療和療效預測中都發(fā)揮著越來越重要的作用；以流式免疫分型為主體的MICM分型方法取代了以形態(tài)學為依據的FAB分型，使白血病分型更趨細致和精確；流式CD34細胞計數法取代了體外集落形成單位計數法，為評估干細胞采集效果提供了簡單、快速的方法；通過流式細胞儀研究Th1/Th2、Treg、Th17等重要免疫細胞，為闡明某些疾病的發(fā)病機制提供更多證據。隨著時間的推移，流式細胞儀將在臨床醫(yī)學領域扮演著越來越重要的角色。

 

從單色向多色

 

       早期，流式細胞儀在科研中的主要應用是DNA含量測定，這種技術要求不高，配備一個散射光和一個熒光通道的流式細胞儀就可以完成檢測。不過1975年Köhler和Milstein建立單克隆抗體制備技術之后，越來越多新抗體和熒光染料被發(fā)現，科學家們可以同時使用多個熒光標記抗體來研究細胞，因此對多激光、多熒光流式細胞儀的需求越來越大。
      多色流式細胞儀可以同時收集更多的細胞信息，意味著在得到相同的參數和信息的情況下，可以減少樣本測試的次數。上世紀80年代，在使用雙色（熒光）流式細胞儀時，要完成淋巴細胞亞群（T、B、NK細胞）的鑒別需要6次測試。但隨著4~6色流式細胞儀的出現，只需1~2次測試就可完成。當然熒光數量也并非越多越好，太多的熒光信號除了增加儀器成本外，它們之間還會相互“滲漏”，使熒光補償變得異常復雜和繁瑣，甚至可能導致補償錯誤而影響檢測結果。

 

從相對到絕對

 

      由于技術原理上的限制，早期的流式細胞儀只能進行被測細胞的百分比測試，卻無法直接輸出細胞的絕對濃度（單位體積內的細胞數，又稱絕對計數）。隨著臨床研究的不斷深入，科研人員發(fā)現某些被測細胞的濃度對于臨床診斷和治療具有非常重要的意義。例如，WHO就建議以“ CD4+細胞小于500個/μL ”作為啟動抗逆轉錄病毒治療的重要依據。
       為了解決絕對計數的問題，傳統(tǒng)流式細胞儀主要使用雙平臺法和微球法。雙平臺法分別從血細胞分析儀和流式細胞儀獲得相關細胞的絕對值和百分比，再通過二者的乘積得出被測細胞的絕對計數值。由于該法需要使用兩種儀器，操作步驟多、變異系數大，不同實驗室之間的差異也較大，因此已逐漸被其它方法所取代。微球法則是把被測樣本加入到具有已知數量微球的試管中，然后通過被測細胞和微球的比例關系來進行絕對計數。由于計數微球價格較為昂貴，測試成本過高，這種方法一直未被臨床廣泛采用。

 

從傳統(tǒng)到質譜

 

       隨著多激光多色流式細胞儀的發(fā)展，人們發(fā)現熒光素發(fā)光光譜間的泄漏和補償成為多色流式細胞分析儀應用的一個約束。質譜流式細胞儀是在通過流式細胞分析的過程中結合了質譜儀的測量方法，采用金屬元素標記物偶聯特異性抗體，然后利用流式細胞術原理分離單個細胞，再使用感應耦合等離子質譜（ICP-MS）測量單個細胞的原子質量譜，將原子質量譜的數據轉換為細胞表面和內部抗原分子的數據。

       與傳統(tǒng)流式細胞技術相比，金屬元素同位素質譜峰非常窄小，利用質譜流式細胞技術完全可以克服熒光素發(fā)光光譜的相互泄漏問題，即使幾十個甚至上百個測試通道也互不干擾，這在傳統(tǒng)流式細胞儀上是無法想象的。

2018年諾貝爾獲得者James P.Allison和Fludigm公司的質譜流式細胞儀Helios

       CyTOF平臺最初由DVS Sciences公司開發(fā)，后被Fluidigm公司收購。儀器采用同位素標記抗體來標記或識別細胞表面和內部的信號分子，并根據流式細胞原理分離單個細胞，再用感應耦合等離子質譜（ICP-MS）觀察單個細胞的原子質量譜，最后將原子質量譜的數據轉換為細胞表面和內部的信號分子數。

 

內容摘選自邁瑞流式