檢測(cè)細(xì)胞因子是判斷機(jī)體免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)。運(yùn)用熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞因子單抗進(jìn)行胞內(nèi)流式分析(Intracellular Flow Cytometry,ICFC)結(jié)合熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞表面抗原單抗應(yīng)用,不僅可以檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的多種因子,還可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。

      應(yīng)用ICFC檢測(cè)細(xì)胞因子的一般步驟:

       （1）活化細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞和纖維細(xì)胞)均可產(chǎn)生細(xì)胞因子。目前用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的多是淋巴細(xì)胞、PBMC和全血。除在病理情況下, 對(duì)過(guò)高表達(dá)的細(xì)胞因子可直接取樣品細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)外,通常檢測(cè)細(xì)胞因子一般都需要先激活細(xì)胞。PMA 和離子霉素為常用的激活劑, 他們可作用于蛋白激酶C ( PKC）使細(xì)胞活化并產(chǎn)生細(xì)胞因子。待檢細(xì)胞同激活劑共孵育的時(shí)間因細(xì)胞類型的不同而異, 一般孵育4～6 h足夠。值得注意的是, 一些細(xì)胞可因PMA和離子霉素的刺激而死亡, 且隨著孵育時(shí)間
的延長(zhǎng)(超過(guò)24 h)死亡的細(xì)胞數(shù)增多。死亡的細(xì)胞可釋放DNA鏈, 誘導(dǎo)其他細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)而干擾對(duì)后續(xù)步驟的分析, 并可嚴(yán)重影響檢測(cè)的結(jié)果, 因此, 必須控制細(xì)胞的死亡數(shù)。

      （2）抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)　在激活細(xì)胞的同時(shí), 需用細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(常用的是Monensin和Brefeldin A)使其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)積聚在細(xì)胞內(nèi), 以增加檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度。但由于Monensin和BFA具有時(shí)間- 劑量依賴的細(xì)胞毒性, 因此處理細(xì)胞的時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng), Monensin的處理時(shí)間若超過(guò)12 h, 可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。若需長(zhǎng)時(shí)間激活細(xì)胞, 應(yīng)在激活的最后階段加入抑制劑。若以抗原肽作為刺激物, 由于不需要抗原加工的過(guò)程, 因此, 從一開(kāi)始孵育細(xì)胞時(shí), 就加入BFA。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞因子, BFA 和Monensin這兩種蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑都一樣有效, 但也有例外, 如BFA用于檢測(cè)TNF-α效果最好; 而在用LPS作為激活劑檢測(cè)人PBMC分泌的IL-10時(shí)應(yīng)該用Monensin, 否則將檢測(cè)不到IL-10。

      （3）封閉Fc受體　許多細(xì)胞表面表達(dá)Fc受體, 如B細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血小板等。他們會(huì)非特異性地結(jié)合檢測(cè)抗體的Fc段造成高背景, 因此, 封閉Fc受體的目的在于減少非特異性免疫熒光染色。在用IgFc受體的封閉試劑處理細(xì)胞時(shí), 對(duì)人和大鼠細(xì)胞可用過(guò)量與熒光抗體來(lái)源相同、但亞型無(wú)關(guān)的純化Ig或血清, 來(lái)阻斷Fc受體;而對(duì)小鼠細(xì)胞可用純化的抗CD16 /32 抗體直接染色以封閉Fc受體。

      （4）細(xì)胞表面分子染色 T細(xì)胞表面可表達(dá)CD3、CD4或CD8分子, 但BFA和Monensin都可能影響細(xì)胞表面分子的表達(dá),如BFA可使CD4的表達(dá)下調(diào), 也可抑制大多數(shù)CD3 +細(xì)胞表面表達(dá)CD69, 但不影響細(xì)胞內(nèi)CD69的表達(dá); 而Monensin則不會(huì)顯著抑制細(xì)胞表面CD69的表達(dá)。其他如CD3、CD8、TCR也可受到影響。所以, 目前多采用淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞早期活化的標(biāo)志CD69, 作為鑒定活化T細(xì)胞的表面標(biāo)志。

      （5）固定和破膜　固定和破膜一般同時(shí)進(jìn)行。固定細(xì)胞是細(xì)胞因子檢測(cè)步驟中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。常用的固定劑多聚甲醛能保護(hù)細(xì)胞形態(tài)的完整性和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的抗原性, 也可防止破劑滲入細(xì)胞。由于一些細(xì)胞表面分子在經(jīng)多聚甲醛處理后會(huì)遭破壞, 所以應(yīng)在細(xì)胞表面分子染色后再適時(shí)加入固定劑。常用的破膜劑是皂角苷, 如果沒(méi)有皂角苷的滲透作用, 熒光素標(biāo)記的抗體只能與細(xì)胞外或細(xì)胞表面的抗原結(jié)合。破膜劑可增加細(xì)胞膜的通透性, 在細(xì)胞膜上形成傳遞通道, 熒光素標(biāo)記的抗體便可通過(guò)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)滲入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的高爾基復(fù)合體, 與細(xì)胞因子或胞內(nèi)其他分子結(jié)合。

     （6）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色　固定和破膜后, 對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行熒光染色最常用的為PE、FITC標(biāo)記的抗體和APC標(biāo)記的抗體。由于不同抗體所針對(duì)的抗原表位不同, 應(yīng)選用不同的熒光素標(biāo)記。對(duì)于弱表達(dá)的抗原(如IL-4)的檢測(cè), 應(yīng)選用強(qiáng)的熒光素PE標(biāo)記抗體; 對(duì)高表達(dá)的IFN-γ的檢測(cè)推薦用FITC標(biāo)記抗體。

    （7）上機(jī)檢測(cè) 洗滌細(xì)胞后, 通過(guò)三色或四色的多參數(shù)流式細(xì)胞分析。檢測(cè)的數(shù)據(jù)是表面Marker和細(xì)胞因子雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)占所設(shè)定細(xì)胞數(shù)的百分率。

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