實驗方法原理

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神經細胞的原代培養(yǎng)是盡量創(chuàng)造最適合于各類神經細胞生長的體外環(huán)境，獲得狀態(tài)良好，純度較高細胞的方法。腦部組織來源的各種神經細胞的培養(yǎng)具有相似的取材過程和部分通用的培養(yǎng)條件。

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實驗材料

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動物組織?

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試劑、試劑盒

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消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA)

完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清＋雙抗）

D-PBS液?

多聚賴氨酸（包被濃度100μg/ml)?

滅菌超純水

75%酒精?

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實驗步驟

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除動物消毒以外，其他步驟都在超凈臺內進行 。

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1. 動物的消毒：根據(jù)培養(yǎng)細胞的類型和要求不同，常用胎鼠和新生鼠做神經細胞的培養(yǎng)。消毒方法分別如下 。

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(1) 孕鼠操作 孕鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，以棉球蘸碘伏擦拭腹部毛皮消毒 。 擦拭從中心向外方向進行，可更換棉球 1- 2次，面積盡量大一些，包括整個腹部和外生殖器周圍 。 用第 1 套解剖器械打開動物腹腔，換第 2 套器械分離子宮并置于含冷 D PBS 的 100mm 玻璃皿中，再換第 3 套器械在每只胎鼠的間隔處剪開子宮并剝離出胎鼠 。

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(2) 仔鼠操作 仔鼠（新生 7d 以內）直接浸泡于冰的 75%酒精中， -20℃冰箱低溫消毒 10min 左右，動物失去知覺即可開始取材 。

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2. 皮層組織的分離：新生鼠使用眼科剪將動物斷頭，并用鑷子剝除頭部的皮膚 。在冰 D -PBS 液中沿顱骨人字縫從后向前剝離 。 一般左手持彎鑷，在動物兩眼處以適當力度固定； 右手持直鑷，完成剝除皮膚 、 骨骼以及分離組織等工作 。 在顯微鏡下利用精細器械分離皮層或海馬時，沿皮層邊緣以 45° 角小心劃開，并逐步使之剝離，轉移組織入盛有冰 D - PBS 液的 35mm 小皿中；然后用精細器械仔細去除每個皮層或海馬的腦膜（整個過程需要在低溫冰袋上完成） 。

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3.組織的分散；用管口較粗的彎頭滴管吸去帶有腦膜的 D - PBS, 盡最去除干凈液體并避免吸走組織；用虹膜剪將組織逐撮均勻剪成乳糜狀，使組織塊為 1mm³?的大小為宜 。 加入合適體積的消化液（一般蓋過組織塊并且可以隨意搖晃即可），并均勻分散組織，放入37°C 孵育箱中消化約 15min (每間隔 3 -5min 用手輕輕搖晃1次，動物胎齡越小，越容易分散，消化時間可相應縮短） 。

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4. 單細胞懸液的制備!用口徑較粗的彎頭滴管將消化好的組織吸入含 3 - 5ml 冰的完全培養(yǎng)基的 10ml 離心管中，靜置 5min 左右 。 用同樣的滴管將沉底的組織轉移到另 一個含約 5ml 冰的完全培養(yǎng)基的 10ml 離心管中，并開始吹打 。 吹打時每次不超過 15 次，先用粗口徑的彎頭滴管吹散，靜置片刻后將上清用細口徑彎頭滴管轉移至另 一個離心管中，并再吹打 15 次左右 。 在原先含沉淀的離心管中再加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)吹打，并收集上清重復上述過程 。 反復吹打幾次后，組織塊基本消失，將全部上清過 200 目篩網以去除剩余組織塊并收集、計數(shù) 。 離心 (900r/min, 5min) 去除細胞碎片并將細胞重懸至合適的體積，以備后用 。

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來源：《神經生物學實用實驗技術》第四軍醫(yī)大學出版社

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