熒光膜片鉗技術(shù)的發(fā)展

       2000年，Zheng與Zagotta共同努力，一種新的結(jié)合熒光記錄和內(nèi)面向外膜片鉗模式的熒光膜片鉗(PCF)技術(shù)應(yīng)運而生，該技術(shù)最初設(shè)計解決環(huán)核苷酸門控(CNG)通道蛋白與cGMP結(jié)合所產(chǎn)生的化學(xué)能如何驅(qū)動通道被激活的問題.首次報道的熒光膜片鉗研究中，將馬來酰亞胺用Alexa Fluor488熒光標記后，觀察其修飾CNG通道蛋白上的半胱氨酸(胞內(nèi)C端環(huán)核苷酸結(jié)合域的C481位點)的作用，通過記錄熒光信號判斷修飾所引發(fā)的通道蛋白結(jié)構(gòu)變化，從而影響cGMP與CNG通道蛋白結(jié)合以及通道的激活.實驗時，采用一根開口大約為幾微米的拋光玻璃電極，封接表達于包含半胱氨酸的離子通道蛋白的細胞膜表面，通過拉回玻璃電極使細胞表面撕下的一小塊細胞膜附著于玻璃電極尖部，熒光團標記和記錄都在這一平方微米尺度的細胞膜片上進行.熒光膜片鉗允許在通道蛋白的胞內(nèi)及胞外兩側(cè)記錄熒光信號.由于熒光信號記錄的是從一小片游離膜上包含的離子通道信息，由胞內(nèi)組分所產(chǎn)生的自發(fā)熒光造成的污染被除去.這使得熒光信號的信噪比增加，從而得到更高的分辨率.當(dāng)結(jié)合高度敏感性、低噪聲的熒光探測器，熒光膜片鉗可以記錄到單獨一個蛋白質(zhì)分子，實現(xiàn)單分子實時記錄.

       基于內(nèi)面向外的熒光膜片鉗被稱為經(jīng)典熒光膜片鉗，而后不同的研究小組也陸續(xù)報道了全細胞模式、細胞貼附模式的熒光膜片鉗，作為熒光膜片鉗技術(shù)的擴展.Yang等將熒光膜片鉗技術(shù)應(yīng)用到HEK全細胞模式下溫度敏感TRP離子通道的溫度激活的實驗研究中，采用全細胞模式，同時記錄通道電流和熒光信號，使得熒光膜片鉗最初的大部分優(yōu)勢得以保留，在電流發(fā)生階段，全細胞熒光膜片鉗只記錄胞外標定的熒光團.到目前為止，熒光膜片鉗被應(yīng)用于CNG通道門控及構(gòu)象變化關(guān)系,CNG通道蛋白亞基配比、HCN通道在超極化激活下配體結(jié)合和門控間的關(guān)系研究.Mony等應(yīng)用熒光膜片鉗結(jié)合熒光電壓鉗，對質(zhì)子通道Hv1的門控研究揭示了通道激活過程中S1和S4的結(jié)構(gòu)重排，指出兩部分在通道活動中既相互獨立又相互影響的特性.最近Nomura等將熒光膜片鉗技術(shù)應(yīng)用于細菌源的機械刺激敏感通道在人工構(gòu)建的脂質(zhì)膜中重組的方向特性研究.毫無疑問，膜片鉗的多種鉗制模式使開發(fā)熒光膜片鉗新方法具有了許多優(yōu)勢.

熒光膜片鉗技術(shù)優(yōu)勢

       熒光膜片鉗技術(shù)對胞膜上離子通道的特異位點采用熒光標記，研究者可以直接觀察發(fā)生在特定通道結(jié)構(gòu)上的實時構(gòu)象重排.半胱氨酸通過基因突變技術(shù)被引入到通道蛋白的興趣位點，如果必要，通道蛋白上原有的半胱氨酸可以通過基因突變被全部替換以確保所有記錄信號的特異性.半胱氨酸殘基作為與巰基特異反應(yīng)的熒光團的定位點，允許特異位點熒光團標定.電流和熒光信號被同時從同一組離子通道蛋白記錄，這是熒光膜片鉗與熒光電壓鉗的主要區(qū)別之一.電流信號，作為通道開放和離子流動的結(jié)果，可做為通道功能的指示器.當(dāng)半胱氨酸附近的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重排影響到熒光團的量子產(chǎn)出、遷移率、與鄰近的熒光團的距離變化等因素時，熒光發(fā)射也發(fā)生改變.這樣，熒光團可作為蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的高度敏感的報告基團.因為熒光信號不像離子電流信號那樣依賴于離子通道孔區(qū)的開放，熒光記錄為探究離子通道蛋白到達開放狀態(tài)前的構(gòu)象變化的時空信息提供了一個新的手段.熒光膜片鉗作為一種全新的研究正常功能下通道蛋白分子活動的方法，可以廣泛應(yīng)用于任何通道類型，甚至可以嘗試非通道的膜蛋白，如轉(zhuǎn)運蛋白、受體蛋白等.研究也表明，熒光記錄也可以成為高通量藥物篩選中電流記錄的有效替代.

      與直徑1 mm的卵母細胞相比，分離的膜片要小得多.那么為什么還能得到足夠強的熒光信號呢？這其中的原因主要有兩個.第一，在HEK細胞膜上可以高密度地表達通道蛋白，對許多離子通道而言，從一片分離的細胞膜上可以得到幾百到幾千個通道分子，因為敏感的光學(xué)探測器(如CCD相機)可以觀察單個熒光分子，成百上千個熒光分子所發(fā)出的熒光在檢測上自然沒有問題.第二，因為膜片很小，這樣就可以使用高采光效率的光學(xué)鏡頭(如40倍數(shù)值孔徑NA值大于1.4的高分辨物鏡)采集整個膜片上所有的熒光信號.與之相比，卵母細胞雖然很大，但大多數(shù)熒光都沒有被收集到.

       熒光膜片鉗記錄提供了優(yōu)越的敏感性和時間分辨率，而且同熒光電壓鉗記錄相比，熒光膜片鉗可以直接控制胞內(nèi)環(huán)境，優(yōu)勢如下：第一，可以面對離子通道胞內(nèi)一側(cè)并對相關(guān)區(qū)域進行標定；第二，排除了由胞內(nèi)環(huán)境所造成的自發(fā)熒光，熒光探測敏感性大為提高；第三，可以施加胞內(nèi)配體及通道調(diào)節(jié)分子來調(diào)節(jié)通道的門控；第四，電流記錄具有更高的時間分辨率。

轉(zhuǎn)自程為等生物化學(xué)與生物物理進展：熒光膜片鉗新技術(shù)的應(yīng)用及進展