取 材

頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取所需的組織，切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透。

注意事項：

①取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。

②切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。

 

切片制備

（1）固定

將切好的組織（＜5mm3）用生理鹽水組織洗一下，立即投入4%多聚甲醛（PFA）或10%中性福爾馬林（NBF）中固定，根據(jù)組織大小和松密程度室溫4-48h。若取材是小鼠大腦或神經(jīng)組織，可以采用灌流的方式進行固定。

注意事項：

①固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20-30倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1-2次新液。

②為了保證組織的新鮮度，盡可能取出后立即放入固定液。

（2）洗滌

材料經(jīng)固定后,水或酒精（若采用含有苦味酸的固定劑bouin，就用酒精洗滌）沖洗，數(shù)小時或過夜，目的是去除組織內(nèi)固定液及結(jié)晶沉淀。

（3）脫水

目的是因為透明劑多是苯類，苯和水不互溶，用到的材料是酒精，將組織依次經(jīng)70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。

注意事項：

①脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。

②在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。

③在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。

④在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。

（4）透明

由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。一般是用純酒精、二甲苯等量混合液浸潤材料1-2h，再換純透明劑（二甲苯、苯、氯仿、正丁醇）。

注意事項：

①使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。

②更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。

③在透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。

（5）浸蠟和包埋

透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲浸到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋。先放入二甲苯和石蠟各半的混合液，再放入熔化的石蠟中浸潤，透蠟時間根據(jù)組織大小而定。浸蠟之后放入包埋盒用石蠟進行包埋。

注意事項：

①操作要迅速，力求在最短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。

（6）切片

通常切片厚度為4-6um，蠟切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當，直接影響切片質(zhì)量。

（7）貼片與烤片

目的是用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中滑落。先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油，蠟片于溫水中（45°C左右）中展平，撈至玻片上鋪正，將載玻片放入45℃溫箱中干燥。

 

脫蠟與復水

脫蠟前，對玻片進行烘烤，56°C 2-3h，其后浸入二甲苯3x5min；然后逐漸用水環(huán)境替代切片樣本中的二甲苯，復水后的所有步驟，切片都要處在水環(huán)境中，防止干片。

 

抗原修復

目的是打開甲醛固定產(chǎn)生的交聯(lián)，以提高組織抗原的檢出率。

熱誘導的表位修復（HIER），HIER對大多數(shù)的抗體有益，尤其是對核抗原的修復作用更加明顯，最常用的抗原修復緩沖液液是pH6.0，10mM的枸櫞酸緩沖液和pH8.0，1mM的EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實現(xiàn)的。最常用的方法有高壓加熱、微波加熱和水域加熱，一般是高壓鍋加熱=微波爐加熱＞水浴鍋加熱。

蛋白酶誘導的表位修復（PIER）:胰蛋白酶(Trpsin)，一般使用濃度為0.1%；胃蛋白酶(Pepsin)，主要用于細胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復。一般濃度為0.4%。

注意事項：

①組織不能干，選擇抗原修復方法要因抗體而異。

 

淬滅

（1）滅活內(nèi)源性過氧化物酶：基于HRP檢測系統(tǒng)，常用的去除內(nèi)源性過氧化物酶的方法是3%過氧化氫水溶液，時間不宜過長，最好室溫10min。

（2）去除內(nèi)源性生物素：基于生物素檢測系統(tǒng)，在采用生物素方法染色前也可以將組織切片進行0.01%卵白素溶液室溫處理20min，使其結(jié)合位點飽和，以消除內(nèi)源性生物素的活性。

（3）滅活堿性磷酸酶（AP）：最常用的方法是將左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值為7.6-8.2，能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶。

 

封閉

利用含5%山羊血清的TBST進行封閉，室溫1h，對于磷酸化特異性抗體而言，不要使用含有酪蛋白的試劑進行封閉。

 

一抗孵育

一般按照一抗說明書上推薦的稀釋液及比例進行稀釋，4°C孵育過夜。

 

清洗

TBST清洗3次，每次5min。

 

二抗孵育

ABC法：利用連接在二抗上生物素募集大量偶聯(lián)親和素的酶進行信號放大

LSAB法：用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶進行信號放大

 

檢測

該表格列舉了常用的酶和搭配的底物及封片介質(zhì)，根據(jù)實驗需要進行選擇。

 

檢測-復染

常用的染料：蘇木精，靶標為細胞核，藍色或紫色；

核固紅：靶標為細胞核，紅色

 

清洗、脫水、封片、觀察

清洗：TBST清洗3次，每次5min

根據(jù)顯色的底物選擇封固劑（例如，DAB采用非水性的封固劑，所以要先脫水，再用中性樹脂封片）

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