免疫分析中出現(xiàn)問題的一個常見原因是干擾性抗體，如眾所周知的人抗鼠抗體（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）、一般的抗動物抗體、嗜異性抗體（Id）或類風(fēng)濕因子（rheumatoid factors，RF）。有趣的是，由于今天的治療性單克隆抗體藥物幾乎完全是人源化的，所以真正的HAMA的流行率正在穩(wěn)步下降。然而，隨著近年來類風(fēng)濕和過敏性疾病等發(fā)病率的上升，抗體引起的干擾在未來仍將具有高度的臨床相關(guān)性，并且似乎進一步增加患病率。一般來說，這些抗體干擾主要發(fā)生在夾心法的免疫分析中，即基于捕獲抗體和檢測抗體（Fig.1）。干擾性抗體可以交聯(lián)捕獲抗體和檢測抗體，導(dǎo)致分析中的高讀數(shù)，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果?；蛘撸鼈兛梢宰柚箍乖c檢測抗體的結(jié)合，甚至引起檢測抗體的聚集，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

Figure 1: Interfering antibodies, like HAMA or rheumatoid factors, can result in false positives or false negatives

SARS-CoV-2抗體檢測通常使用Antigen-down模式（即間接法）聯(lián)合抗檢測抗體進行分析，因此不受影響。相比之下，SARS-CoV-2抗原的免疫分析通常使用夾心法模式，則較容易受到干擾性抗體的影響。

 

判定干擾性抗體是否是導(dǎo)致錯誤結(jié)果的原因，可以使用市面上商業(yè)化的ELISA試劑盒進行檢測，這些試劑盒設(shè)計用于鑒別嗜異性抗體、HAMA和RF（通常簡稱為HAMA-ELISA）。鑒定確認后，常使用HAMA阻斷劑來解決此類干擾問題。這種解決方案的缺點是更多的生物活性成分-抗體-被添加到分析中，這可能會帶來新的干擾。通常情況，多數(shù)生產(chǎn)商會提供幾種不同的HAMA阻斷劑，因為沒有特定的阻斷劑可以適用于所有的分析。每次檢測時，HAMA阻斷劑的最有效濃度也必須進行仔細滴定。對于給定的分析和干擾樣品組合，必須進行非常嚴格的測試，才能找到合適的HAMA阻斷劑。

 

此外，盡管干擾性抗體在相關(guān)文獻中占主導(dǎo)地位，但在免疫分析中通常也會觀察到許多其他類型的與抗體無關(guān)的干擾。干擾也可能由樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)引起，例如由于分析物被封閉、交叉反應(yīng)或一般基質(zhì)效應(yīng)，如高脂和高鹽濃度、高粘度，這些類型的干擾在SARS-CoV-2免疫分析中也常常發(fā)生。許多內(nèi)源性物質(zhì)，如白蛋白、補體因子、溶血酶、α-1抗胰蛋白酶或纖維蛋白原等高度豐富的血清蛋白都會干擾免疫分析。此外，標記檢測抗體或示蹤劑分析物是免疫分析中的常見做法。用到的標簽可以是酶（如堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP））、熒光染料、放射性同位素、親和力標簽（如生物素），或者DNA（immuno-PCR中采用）。這些標簽也會改變標記對象的屬性，并帶來新的干擾。

 

親和力鑒別法消除干擾

 

以上提到的這些干擾有一個共同點：它們是由中低親和力結(jié)合問題引起的。相反，一個好的抗體與其表位之間的特異性相互作用具有很高的親和力。然而，即使足夠數(shù)量的低親和力結(jié)合也會導(dǎo)致高分析讀數(shù)，產(chǎn)生特定的假陽性結(jié)果，或者高背景和壞的信噪比。一種潛在的方法是使用高濃度的分析稀釋劑來減少這些有問題的中低親和力相互作用的影響。然而，這些高濃度的條件也會對高親和力結(jié)合產(chǎn)生負面影響，從而影響分析的正確信號。因此，高濃度緩沖液不是一個有用的選擇。

 

減少低親和力和中親和力結(jié)合作用而不影響高親和力結(jié)合的唯一方法是親和力鑒別。15年前，CANDOR BIOSCIENCE的LowCross Buffer®產(chǎn)品成功引入了這種作用模式，此后消除了數(shù)百萬樣本中的干擾。如果用于樣品和抗體稀釋，這些親和力鑒別溶液可以消除基于低或中等親和力結(jié)合的所有干擾，同時保持特定信號。因此，它們大大減少了背景，提高了信噪比，并提高了結(jié)果的再現(xiàn)性（Fig.2）。與僅防止干擾性抗體干擾的HAMA阻斷劑不同，LowCross Buffer®能夠消除上述各種干擾。因此，這種基于親和力鑒別的稀釋劑可用于任何受到干擾的免疫分析。無需對分子基礎(chǔ)進行耗時的更深入的研究，也無需仔細選擇和滴定不同的HAMA阻斷劑。在分析過程中，所有的結(jié)合反應(yīng)都必須在親和選擇性條件下進行。由于許多診斷試劑盒需要長時間儲存檢測抗體，CANDOR還提供LowCross HRP®，它即包含了親和力鑒別的優(yōu)點，也具有維持過氧化物酶標記的檢測抗體的長期穩(wěn)定的功能。

Figure 2: Prevention of false-positive binding using LowCross-Buffer® in an ELISA against guinea-pig IgG. With the standard assay buffer (a), false positives in the specificity control (row A) and in the blank values (row H) spoiled the interpretations and evaluation. The use of LowCross-Buffer® (b) prevented all false-positive signals. Assay performed by Dr. C. Specht (PARA Bioscience GmbH (now vivo Science GmbH), Gronau, Germany)

進行針對SARS-CoV-2 RBD抗體的通用的Antigen-down檢測抗體分析，一種采用標準稀釋液PBS-T/BSA，另一種采用CANDOR的特色產(chǎn)品（包括LowCross Buffer®作為實驗稀釋劑）的增強方案，兩者進行比較，可以發(fā)現(xiàn)親和力鑒別的積極效果（Fig.3）。在陽性樣品的最大信號幾乎不變的情況下，陰性樣品的背景和樣品間的變化大大改善，從而獲得了更好的檢測限。減少背景和陰性樣本的變化，同時改善信噪比可以防止許多假陽性結(jié)果。如上所述，在SARS-CoV-2抗體檢測中，應(yīng)不惜一切代價避免出現(xiàn)假陽性，例如來自相關(guān)冠狀病毒抗體的假陽性。此外，用親和力鑒別稀釋液制備的優(yōu)良抗體檢測方法也有助于指導(dǎo)SARS-CoV-2疫苗的研制。

 

抗原檢測通常由于粘液和唾液的復(fù)雜基質(zhì)以及檢測涉及完整和破碎病毒顆粒的混合物而變得復(fù)雜。此外，分析方法多樣，從經(jīng)典的夾心法分析到基于ACE2的雙重分析都有。假陰性結(jié)果必須減少到最低限度，以防止感染者因“確認無病毒”而變得粗心。許多潛在的致命感染可以通過這種方式傳播。不論樣品基質(zhì)效應(yīng)和存在的類型如何，親和力鑒別都能夠提高分析性能，防止各種未知干擾源。因此，在開發(fā)早期，LowCross Buffer®可以防止分析開發(fā)和驗證過程中的許多障礙。這不僅為開發(fā)人員節(jié)省了時間和金錢，而且更快地將可靠的抗原分析方法提供給公眾。

Figure 3: Improving an RBD-based SARS-CoV-2 antibody ELISA using LowCross-Buffer. Comparison of negative samples (# 1-20; Ø is arithmetic mean of 1-20) LowCross protocol vs. the standard diluent PBS/Tween/BSA (PBS-T/BSA). Samples were analyzed either using the CANDOR solutions, including LowCross-Buffer, or a standard PBS-T/BSA protocol. The LowCross protocol allows for less average background, less sample-to-sample variation, a better signal-to-noise-ratio, and a better detection limit due to a decreased cut-off. (Samples provided by in.vent Diagnostica GmbH, Henningsdorf, Germany.)

親和力鑒別主要通過創(chuàng)建親和力截止值來工作。相互作用中親和力低于截止值的減少，而高親和力結(jié)合不變。因此，當(dāng)檢測抗體對目標分析物有很高的親和力時，這個概念最有效，并且可以設(shè)置較高的截止值。對于這些高親和力抗體，CANDOR提供了LowCross Buffer®STRONG，與經(jīng)典變體相比，它能防止更多不必要的相互作用。相反，某些檢測模式，如自身免疫檢測，必須依賴于較低親和力的相互作用，不能使用經(jīng)典LowCross Buffer®設(shè)置的截止值進行。對于這些分析，LowCross Buffer®MILD可能是有益的。盡管如此，對于大多數(shù)應(yīng)用，LowCross Buffer®的經(jīng)典配方可完美平衡干擾抑制和真正信號保護。

 

結(jié)論

 

基于親和力鑒別的稀釋緩沖液具有處理多種不同干擾的潛力，而不需要關(guān)于干擾分子起源的詳細信息。無需額外的處理步驟，提供了分析性能和可靠性。這些改進不僅在SARS-CoV-2免疫檢測的高度關(guān)鍵性背景下至關(guān)重要，而且在根據(jù)歐盟體外診斷法規(guī)（IVDR）驗證診斷試劑盒時，也將有助于節(jié)省時間和成本，該法規(guī)將于2022年5月全面生效。每種樣品只需幾美分的成本，親和力鑒別稀釋劑無論是在SARS-CoV-2流行病的背景下開發(fā)的研究，還是用于人類或獸醫(yī)診斷、食品測試或生物分析的其他目的，都可以極大地促進免疫分析的改進。CANDOR一直保持所有產(chǎn)品的最高質(zhì)量標準，并均在EN ISO 9001和EN ISO 13485認證的生產(chǎn)設(shè)施中完成“德國制造”。

 

參考文獻

1: Richter, SM et al. (2020) The challenges of serology - towards reliable SARS-CoV-2 antibody assays. www.biocompare.com/Future-Lab/Diagnostics

2: Richter, SM (2020). Specificity, positive predictive value and validation statistics in the context of CoViD-19. Free for

download on www.candor-bioscience.de; 4-2020

3: Kroll, MH and Elin, RJ (1994) Interference with Clinical Laboratory Analyses. Clinical Chemistry

4: Klee, GG (2000) Human Anti-Mouse Antibodies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine

5: Polifke, T and Rauch, P (2009) Affinity discrimination to avoid interference in assays. IVD Technology

6: Selby, C (1999) Interference in Immunoassays. Annals of Clinical Biochemistry

7: Wood, WG (1991) Matrix Effects in Immunoassays. Scandinavian Journal for Clinical Laboratory Investigations

8: Miller, JJ (2004) Interference in Immunoassays: Avoiding Erroneous Results. Clinical Laboratory International

 

相關(guān)產(chǎn)品

LowCross-Buffer®

LowCross® HRP-Stab