診斷試劑盒中試劑等組分的穩(wěn)定性對于商業(yè)化的檢測至關重要?，F(xiàn)今穩(wěn)定劑不僅可以延長保質(zhì)期，而且可以提高檢測試劑盒的可靠性。以SARS-CoV-2抗原為例，我們將解釋商業(yè)化穩(wěn)定劑如何在優(yōu)化工作流程的同時提高分析質(zhì)量。

如果在開發(fā)過程中沒有充分考慮組分的穩(wěn)定性，即使是技術上最先進、設計最完善的診斷檢測，通常也無法實現(xiàn)商業(yè)化。根據(jù)將于2022年5月生效的歐盟體外診斷法規(guī)（IVDR），診斷試劑盒的分析性能在其保質(zhì)期內(nèi)不得改變。這使得保證組分的穩(wěn)定性成為試劑盒進入市場的先決條件。通過使用商業(yè)化的蛋白質(zhì)和結合物穩(wěn)定劑，例如CANDOR的Antibody Stabilizer、HRP-Protector?和AP-Protector?，可以大大提高對照品和檢測抗體-結合物的穩(wěn)定性。本文以ELISAs為例，重點討論固相穩(wěn)定、表面包被捕獲分子的活性維持的機理和解決方案。此外，本文概述的原理和解決方案也可以應用于其他包被表面，如聚苯乙烯或玻璃表面的實驗應用，如側向層析、親和柱、基于微球的分析、免疫PCR或蛋白質(zhì)分析等。

包被的捕獲分子如抗體，或在抗原下降分析中分離的病毒蛋白，是可靠免疫分析的核心組成部分。它們的錯誤折疊，如天然結構的丟失，是任何分析的一個重大問題，因為它會引起抗體結合部位、抗體的抗原結合區(qū)或抗原的表位的改變，這兩者都是待測物結合所必需的。因此，捕獲分子無法結合待測物，甚至可能由于暴露天然未暴露的氨基酸序列和結構而發(fā)生非特異性結合，導致診斷試驗顯示錯誤的結果。由于表面效應引起的空間結構和構象的改變，抗體在包被過程中會發(fā)生錯誤折疊。在ELISA微孔板中，只有3-10%的包被抗體具有良好的定向性和與待測物結合的功能活性?？乖灰灿蓄愃频那闆r。在大多數(shù)情況下，很少量的活性成分就足以完成一次檢測，因為捕獲分子通常使用大量過剩。

即使在成功包被后，錯誤折疊也會因為時間和溫度的變化而發(fā)生。隨著時間的推移，包被分子會失去結合待測物的能力。如果包被板是預期保質(zhì)期為幾年的診斷試劑盒的一部分，則最先進的穩(wěn)定性對于其性能維持至關重要。否則，由于信噪比降低和潛在的非特異性相互作用，試劑盒的性能會隨著捕獲分子的錯誤折疊而降低，從而導致假陰性和假陽性。尤其是單克隆抗體在表面上的穩(wěn)定性通常較低。在抗原下降分析中，一些包被抗原在不添加穩(wěn)定劑的情況下，4℃儲存兩周后會失去捕獲待測物的能力。

因此，在開發(fā)商業(yè)化試劑盒的早期，應考慮其穩(wěn)定性。簡單的方法，如使用BSA作為穩(wěn)定劑，對包被捕獲分子的穩(wěn)定性沒有顯著影響，并且無法保持板的功能性（Fig.1a）。更有效的是自20世紀80年代以來診斷生產(chǎn)中使用的的糖或碳水化合物溶液。這些溶液能夠在確保持續(xù)制冷的情況下充分維持包被板的穩(wěn)定性，從而成為第一個真正的固相穩(wěn)定劑。這種以糖為基礎的穩(wěn)定劑通?？杀３职宓谋Ｙ|(zhì)期在一年的范圍內(nèi)，但在此期間質(zhì)量略有下降是常見的。由德國CANDOR BIOSCIENCE提供的Liquid Plate Sealer?（Fig.1b），與碳水化合物溶液相比，具有更多的優(yōu)勢，而不僅僅是進一步提高了板的穩(wěn)定性。

Figure 1: Calibration curves of an ELISA that was either blocked only with BSA (left panel) or blocked with BSA and additionally stabilized with Liquid Plate Sealer? (right panel).

由于干燥過程中水化膜的蒸發(fā)和與空氣的直接接觸，蛋白質(zhì)的二級和三級結構被破壞，從而失去活性。為了防止這種錯誤折疊，有必要用一個封閉而均勻的保護層來密封包被的捕獲分子。這是現(xiàn)代包被穩(wěn)定劑的主要作用模式，如Liquid Plate Sealer?。除這一基本功能外，很多情況下，Liquid Plate Sealer?（由于成分削弱了表面的負面影響）還可以重新激活一些在包被過程中錯誤折疊的抗體或蛋白質(zhì)，從而導致發(fā)揮功能的抗體的增加。由Liquid Plate Sealer?形成的保護層即使在溫度應力下也能保持捕獲分子的構象。盡管其優(yōu)異的保護性能，但形成的層很容易溶解，因此穩(wěn)定過的ELISA板儲存后無需額外洗滌，樣品可以直接添加入其中。

除了保持分析性能，現(xiàn)代固相穩(wěn)定劑也有助于優(yōu)化生產(chǎn)過程。更長的保質(zhì)期允許更多的生產(chǎn)批次，因為試劑盒可以保存更長的時間。這不僅降低了成本，因為它節(jié)省了批量放行和機器設置時間，而且還減少了批間差異，因為客戶可以延長使用同一批的時間?，F(xiàn)代穩(wěn)定劑（如Liquid Plate Sealer?）的高批次間一致性進一步補充了這一點。更長的保質(zhì)期也有利于手工實驗室分析，因為它們經(jīng)常用于檢測SARS-CoV-2抗體，因為更大的批量可以節(jié)省制備時間，并改善這些設置中的分析間差異，從而產(chǎn)生更具可比性和可靠性的結果。

此外，Liquid Plate Sealer?也可作為封閉劑，用于經(jīng)典夾心法ELISA中進行一步到位的表面封閉和穩(wěn)定（Fig.2）。這種操作步驟的減少可以優(yōu)化診斷試劑盒的大規(guī)模生產(chǎn)過程，并降低成本。然而，有些分析需要更有效的表面封閉。在這種情況下，一個優(yōu)越的表面封閉劑，如PlateBlock? 對于SARS-CoV-2抗體的血清學檢測或The Blocking Solution對于夾心法ELISA檢測，是更好的選擇。這兩款表面封閉劑都是由CANDOR開發(fā)的，用于高質(zhì)量的免疫診斷。Liquid Plate Sealer?與目前測試的所有表面封閉試劑兼容。

Figure 2: High-speed ELISA plate production with Liquid Plate Sealer? as blocking reagent and coating stabilizer in a single process step is suitable for sandwich ELISA and competitive tests.

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相關產(chǎn)品

Liquid Plate Sealer?

PlateBlock?

The Blocking Solution

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