免疫分析法是使用抗體檢測不同物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)分析方法。它們通常用于生命科學(xué)行業(yè)的生物分析和生化實(shí)驗(yàn)室。這些方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、免疫印跡 (WB)、放射免疫分析(RIA)、蛋白質(zhì)陣列、免疫組化(IHC)或免疫聚合酶鏈反應(yīng)(Immuno-PCR)。在各種免疫分析法中，待測物的檢測都可能受到干擾的影響。如經(jīng)常發(fā)生的交叉反應(yīng)、非特異性結(jié)合和基質(zhì)效應(yīng)。干擾物質(zhì)在真實(shí)標(biāo)本中以或多或少的顯著濃度水平存在，并與待測物或捕獲檢測抗體相互作用。通過使用一種新的緩沖液(Lowcross-Buffer)，替代傳統(tǒng)緩沖液，大多數(shù)干擾影響都可以避免。通過這種替換，提高了分析方法的質(zhì)量和分析方法開發(fā)的效率。

尼爾斯·杰尼因其在免疫系統(tǒng)的構(gòu)建和控制特異性方面的貢獻(xiàn)獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他在頒獎(jiǎng)演講中提到，每一種抗體都是多特異性的。他將這一說法與免疫反應(yīng)早期階段的抗體產(chǎn)生聯(lián)系起來。與目標(biāo)分析物具有高親和力的抗體偶爾會(huì)顯示出令人驚訝的結(jié)果：在包被捕獲抗體的免疫檢測中，免疫印跡膜中不必要的條帶被染色，蛋白質(zhì)陣列上得到錯(cuò)誤斑點(diǎn)的熒光信號以及空白樣本的高背景信號。ELISA檢測中，得到陰性信號的高背景或假陰性結(jié)果。由于干擾效應(yīng)造成的錯(cuò)誤結(jié)果可能導(dǎo)致后續(xù)成本浪費(fèi)和錯(cuò)誤診斷。

所有的免疫分析方法的特征是在目標(biāo)分析物和抗體之間的結(jié)合反應(yīng)。這些方法存在的問題是經(jīng)常發(fā)生的干擾，導(dǎo)致了錯(cuò)誤的檢測，這個(gè)問題至今未得到充分地解決。典型的干擾有非特異性結(jié)合，導(dǎo)致較差的信噪比和高背景， 交叉反應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)。簡單地說，這些效應(yīng)大多是基于分析物、捕獲抗體或檢測抗體與外部物質(zhì)或表面的直接相互作用。圖1表示了一種典型干擾效應(yīng)的簡化方案。在技術(shù)文獻(xiàn)中經(jīng)常被描述的已知的干擾因素有如異嗜性抗體和HAMAs（人抗小鼠抗體）、類風(fēng)濕性因子、白蛋白、補(bǔ)體，溶菌酶以及其他等。

免疫分析標(biāo)記帶來的干擾

在免疫分析中標(biāo)記檢測抗體非常常見，譬如在競爭法中，標(biāo)記待測分析物。經(jīng)常使用的標(biāo)記有酶（堿性磷酸酶或（辣根）過氧化物酶）、熒光染料、放射性同位素或DNA(用于免疫PCR)。不必要的影響也出現(xiàn)在這里。危險(xiǎn)在于，使用熒光染料作為標(biāo)記，這類疏水染料會(huì)改變檢測抗體的結(jié)合能力，導(dǎo)致染料本身的非期望的結(jié)合，且降低了標(biāo)記 蛋白的溶解度。此外，抗原與抗體的結(jié)合也會(huì)變?nèi)酢＠?，這些非特異性效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致抗體與表面(圖1A和B)、與樣品中的外部蛋白質(zhì)(圖1C)或?qū)Σ东@抗體(圖1D)的結(jié)合增加。在這些情況下，會(huì)導(dǎo)致在沒有分析物存在時(shí)出現(xiàn)假陽性或整個(gè)檢測出現(xiàn)高背景。在蛋白質(zhì)芯片上觀察到單個(gè)斑點(diǎn)的背景熒光增加，或信噪比完全變糟糕。同樣，血清樣本中的蛋白質(zhì)或抗體也可以與熒光染料結(jié)合，減少甚至封閉染料的熒光。因此，一些研究人員已經(jīng)建議放棄熒光染料作為蛋白質(zhì)陣列的標(biāo)記或選擇其他標(biāo)記。蛋白質(zhì)芯片上的反應(yīng)是非常復(fù)雜的，因?yàn)樵谝粋€(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)使用多種不同的捕獲抗體和標(biāo)記的檢測抗體。因此，樣本中蛋白質(zhì)或標(biāo)記抗體與單點(diǎn)的非特異性結(jié)合的概率升高， 同時(shí)樣本中成分與抗體的結(jié)合帶來的干擾效應(yīng)也隨之增加。

交叉反應(yīng)帶來的干擾

交叉反應(yīng)是指抗體也與目標(biāo)分析物以外的其他結(jié)構(gòu)結(jié)合的能力(圖1, I-K)。通常這些結(jié)構(gòu)與被分析物有很大的相似性。因此，具有相似分子結(jié)構(gòu)的代謝物或化學(xué)物質(zhì)就是例子。氨基酸序列具有巧合相似性或同源性的蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。特別是在競爭法分析中，因?yàn)橹皇怯昧艘环N抗體，交叉反應(yīng)發(fā)揮更大的作用。為了確認(rèn)此類分析，對經(jīng)?？赡馨l(fā)生的交叉反應(yīng)物質(zhì)和交叉反應(yīng)需要被量化。

交叉反應(yīng)也可以在蛋白印跡檢測或免疫組化實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。盡管人們不知道在每種情況下，這些不必要的結(jié)合的確切分子機(jī)制，交叉反應(yīng)在其他條帶或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的染色中變得很明顯。在蛋白印跡檢測中，人們假設(shè)在許多情況下降解正確蛋白質(zhì)的產(chǎn)物是自然的或合理的方式造成的。但在某些情況下，這并不是事實(shí)，我們需要考慮一抗或二抗的交叉反應(yīng)。

圖1: 在免疫分析中可能出現(xiàn)的不同干擾效應(yīng)的示意圖。

A: 標(biāo)記的檢測抗體與未封閉的表面的非特異性結(jié)合。結(jié)果是假陽性信號。

B: 標(biāo)記的檢測抗體與封閉表面的非特異性結(jié)合。盡管表面被封閉，但抗體與封閉蛋白相結(jié)合。結(jié)果是假陽性信號。

C: 干擾蛋白與檢測抗體的Fc片段結(jié)合，并在空間上阻礙待測物的結(jié)合。結(jié)果是假陰性信號。

D: 捕獲抗體與檢測抗體的Fc片段結(jié)合。結(jié)果是假陽性信號。待檢測物不能再與捕獲抗體結(jié)合。

E: 不受影響的試驗(yàn)，沒有任何干擾。理想的狀態(tài)。

F: 通過異嗜性抗體或HAMAs進(jìn)行的橋接結(jié)合。通過此方法，捕獲抗體與檢測抗體連接，從而產(chǎn)生假陽性信號。

G: 一種與捕獲抗體具有抗獨(dú)特型結(jié)合特性的HAMA。干擾抗體結(jié)合在捕獲抗體Fab片段的高度可變區(qū)域，從而阻止了待測物的結(jié)合。因此，就會(huì)出現(xiàn)假陰性信號。

H：一種與檢測抗體具有抗獨(dú)特型結(jié)合特性的HAMA。干擾抗體結(jié)合在檢測抗體Fab片段的高度可變區(qū)域，并阻止待測物的結(jié)合。結(jié)果，出現(xiàn)了假陰性信號。

I：干擾物質(zhì)與捕獲抗體的交叉反應(yīng)性。結(jié)果是假陰性信號。

J：干擾物質(zhì)與檢測抗體的交叉反應(yīng)性。結(jié)果是假陰性信號。

K：與捕獲抗體和與檢測抗體的交叉反應(yīng)性。這種現(xiàn)象在實(shí)踐中很少出現(xiàn)，這種抗體的特異性肯定較低。這種干擾現(xiàn)象也可以發(fā)生在待測物具有蛋白質(zhì)保守氨基酸序列，該序列也出現(xiàn)在其他蛋白質(zhì)上。

L：樣本中的其他蛋白質(zhì)掩蔽待測物，使其表位被封閉，無法與捕獲抗體結(jié)合，或空間位阻情況嚴(yán)重。結(jié)果是假陰性信號。

非特異性結(jié)合帶來的干擾

與交叉反應(yīng)密切相關(guān)的是非特異性結(jié)合。然而，兩者在分子水平上的機(jī)理有所不同。在日常的實(shí)驗(yàn)室工作中， 這些差異不明顯。交叉反應(yīng)中，造成交叉反應(yīng)的物質(zhì)是已知的，并且它的交叉反應(yīng)性可以定量，譬如與交叉反應(yīng)物的濃度競爭關(guān)系。而在非特異性結(jié)合的情況下，結(jié)合涉及的物質(zhì)， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目標(biāo)分析物(如與白蛋白或免疫球蛋白的非特異性結(jié)合)或與表面(如ELISA孔或免疫印跡膜表面)或蛋白質(zhì)芯片中的固定抗體斑點(diǎn)。

基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是樣本中所含成分帶來的干擾效應(yīng)的總和，影響目標(biāo)分析物的檢測。如果產(chǎn)生干擾的真正分子原因還沒有確定，但人們知道它來自于樣本，那么一般就稱之為“基質(zhì)效應(yīng)”。從一種效應(yīng)到另一種效應(yīng)的邊界是不固定的，有時(shí)并不清晰。一些基質(zhì)效應(yīng)來自“抗動(dòng)物抗體”，另一些來自異嗜性抗體，或來自內(nèi)源性干擾，或僅僅來自粘度、ph值或僅僅來自鹽濃度。

抗動(dòng)物抗體產(chǎn)生的干擾

人抗動(dòng)物抗體(HAAA)可為IgG-、IgA、IgM或IgE型。它們是免疫系統(tǒng)應(yīng)答的一部分，與動(dòng)物來源的免疫球蛋白結(jié)合。HAAAs在許多診斷性免疫分析中是眾所周知的干擾物，有時(shí)可能是80%的臨床標(biāo)本的一部分——取決于具體應(yīng)用研究。HAAAs的濃度最高可達(dá)每毫升數(shù)毫克。

人抗小鼠抗體(HAMA)是免疫分析中最常見的干擾抗體。HAMAs是人類抗體，具有顯著的特異性，有時(shí)具有明顯的小鼠抗體親和力?；颊唧w內(nèi)產(chǎn)生這些抗體的原因通常是使用治療性抗體藥物治療癌癥而產(chǎn)生。用藥后，患者的免疫系統(tǒng)會(huì)對這些外源性抗體產(chǎn)生反應(yīng)，形成針對治療性小鼠抗體的自身抗體。因此，如果免疫分析中使用小鼠抗體作為分析試劑， HAMAs會(huì)干擾免疫檢測結(jié)果。在使用小鼠單克隆抗體的夾心法分析中，這可 以導(dǎo)致捕獲抗體和檢測抗體之間的直接結(jié)合，而無需任何分析物(圖1F)。這會(huì)導(dǎo)致假陽性信號。來自不同物種的抗體序列有相似之處。這意味著，含HAMAs的血清也可能會(huì)在使用來自其他物種的抗體的檢測中產(chǎn)生問題，并產(chǎn)生同樣的錯(cuò)誤信號結(jié)果。

HAMAs不僅來源于抗體治療，長期接觸家畜和寵物，最終也會(huì)形成針對這些動(dòng)物的抗體。有人在患者的血清中發(fā)現(xiàn)了針對兔子、老鼠、狗、倉鼠的抗體。這些抗動(dòng)物抗體干擾了一些具有不同親和力和不同問題的檢測抗體。一些干擾抗體不僅針對檢測抗體的Fc片段，也針對檢測抗體的Fab片段。這可能導(dǎo)致正確結(jié)合減少或完全阻礙，從而導(dǎo)致假陰性信號(圖1G和H)。如果HAAAs與Fc片段結(jié)合，它們被稱為抗同型干擾。如果它們結(jié)合到高度可變的Fab片段上，它們就被稱為抗獨(dú)特型干擾。

異嗜性抗體帶來的干擾

泰伯醫(yī)學(xué)詞典將異嗜性抗體定義為“與特定抗原以外的其他抗原結(jié)合的抗體”。異型抗體可為IgG、IgA、IgM或IgE型。特別是IgM型在風(fēng)濕病患者的血清中起著特殊的作用。這些血清中含有高濃度的所謂類風(fēng)濕性因子。類風(fēng)濕性因子是IgM抗體，可與人類抗體的Fc部分結(jié)合，因此也與實(shí)驗(yàn)中使用的抗體的Fc部分結(jié)合，且與物種無關(guān)。因此，風(fēng)濕病血清將捕獲與檢測抗體連接起來，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。這同時(shí)也是異嗜性抗體的一般干擾機(jī)制。風(fēng)濕病血清的效應(yīng)類似于HAAAs的效應(yīng)。與HAAAs相比的區(qū)別在于異嗜性抗體的來源，他們不是建立在與動(dòng)物免疫球蛋白反應(yīng)的基礎(chǔ)上，而是早期免疫應(yīng)答的多特異性抗體或來源不明的干擾性抗體。

因HAAAs或異嗜性抗體造成的干擾被發(fā)現(xiàn)已有30多年。干擾抗體是來自動(dòng)物源的一般弱結(jié)合抗體，主要干擾由于分析物濃度低，血清或血漿樣本需低稀釋度稀釋的分析。向樣本緩沖液中添加阻斷物——通常是非特異性血清、抗體片段或高濃度的動(dòng)物免疫球蛋白——能夠通過競爭減少HAAAs或異嗜性抗體的干擾效應(yīng)，但不能完全避免。

樣品內(nèi)源性物質(zhì)帶來的干擾

即使是標(biāo)本中天然存在的蛋白質(zhì)也會(huì)干擾免疫分析。人血清中眾所周知的干擾物質(zhì)有白蛋白、補(bǔ)體、溶菌酶和纖維蛋白原。低分子量的分析物可以與白蛋白結(jié)合，這使得抗體與分析物的結(jié)合變得困難。許多激素都與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白結(jié)合，這也可能為免疫分析帶來困難。此外，許多蛋白質(zhì)具有結(jié)合其他物質(zhì)和蛋白質(zhì)的能力。這種結(jié)合能力通常是各自蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的重要組成部分。白蛋白、補(bǔ)體和C反應(yīng)蛋白(CRP) 是多種物質(zhì)的天然受體。因此，非特異性結(jié)合甚至交叉反應(yīng)——如與抗體的反應(yīng)一樣——都是可能發(fā)生的。這使得在免疫檢測中識別某些分析物變得復(fù)雜。內(nèi)源性 蛋白可以作為一種干擾因子與抗體結(jié)合(圖1C,I-K)或掩蔽目標(biāo)分析物(圖1L)。例如，溶菌酶能非特異性地與具有低等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)合。因此，低等電點(diǎn)（約5）的抗體可以與之結(jié)合，并在捕獲抗體和檢測抗體之間建立橋梁。需要提到的一個(gè)重要方面是，含有大量脂質(zhì)的標(biāo)本的干擾，因?yàn)橐恍┓治鑫锸侵苄缘模铱贵w與分析物之間的結(jié)合可能也會(huì)受到脂質(zhì)的影響。

鉤狀效應(yīng)

鉤狀效會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，但與其他干擾效應(yīng)不同的是，它不是通過與干擾因素的相互作用而產(chǎn)生。

免疫分析時(shí)，當(dāng)樣本與分析抗體直接混合，且分析物的濃度非常高時(shí)，鉤狀效應(yīng)就有可能發(fā)生。在這種情況下，當(dāng)分析物的高濃度超過分析抗體的濃度時(shí)， 捕獲抗體和檢測抗體會(huì)出現(xiàn)飽和。因此高濃度被判讀為遠(yuǎn)低于實(shí)際的低濃度， 從而導(dǎo)致對真實(shí)濃度的顯著低估。在實(shí)踐中，通過使用更高濃度的檢測抗體或者稀釋樣本，可以避免鉤狀效應(yīng)?；蛘?，必須對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)化稀釋，以確保檢測值不受鉤狀效應(yīng)的影響。已知的可能受到鉤狀效應(yīng)影響的臨床參數(shù)有： CRP、AFP、CA125、PSA、鐵蛋白、催乳素及TSH等。

使用LowCross Buffer®防止干擾

造成所描述的干擾效應(yīng)的原因是相似的。干擾因子與抗體或分析物之間存在不必要的從低到中的親和作用。標(biāo)記抗體與其他蛋白質(zhì)或表面的低親和力結(jié)合或中親和力結(jié)合，同樣抗體與結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)低到中親和交叉反應(yīng)。LowCross Buffer®利用了這些干擾效應(yīng)的共同之處：干擾反應(yīng)弱于真實(shí)分析物的特異性結(jié)合。當(dāng)然，很少有因發(fā)生非常高的親和的交叉反應(yīng)，達(dá)到與真正特定性結(jié)合相同的結(jié)果。在這種情況下， 人們必須談?wù)撘粋€(gè)特定的結(jié)合，并且在原則上有一個(gè)針對兩種不同物質(zhì)的抗體。因此，這種抗體根本不能用于特定的分析。Low Cross Buffer® 是專門開發(fā)來消除低和中親和力結(jié)合，但不會(huì)對高特異性的高親和力結(jié)合產(chǎn)生任何負(fù)面影響。

圖2到圖5顯示使用LowCross Buffer®可防止免疫分析中典型的干擾效應(yīng)的不同示例。圖2顯示了在蛋白芯片應(yīng)用中使用LowCross Buffer®可降低高背景，并將信噪比從3.4提高到17.3。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對不同多克隆抗EPIL抗體(EPIL=早期胎盤胰島素樣生長因子) 的適用性進(jìn)行了測試。抗體使用濃度為500µg/ml、體積為1.8 nl/spot通過生物芯片打點(diǎn)機(jī)（GMS 417）固定在氨基硅烷化的微陣列載玻片上。隨后，將2ml的EPIL過度表達(dá)細(xì)胞系（SKBR3） 培養(yǎng)基與染料Oyster650P混合，此時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)蛋白質(zhì)被標(biāo)記。分別使用LowCross Buffer®和PBS按照1：20稀釋培養(yǎng)基，加在載玻片上進(jìn)行孵育。沖洗載玻片后，用熒光掃描儀（GMS 418） 進(jìn)行讀取，并用ImaGene分析數(shù)據(jù)。通過使用LowCross Buffer®可以明顯降低背景信號，從而使得更好地區(qū)分單個(gè)抗體是否適用于檢測EPIL。

圖2: 減少檢測抗體與蛋白質(zhì)芯片表面的非特異性結(jié)合。通過使用LowCross-Buffer®，將信噪比從3.4提高到17.3。(數(shù)據(jù)源自N. Dankbar, university of Münster)

圖3顯示用westen blotting法檢測來自肝細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的角蛋白4、5 和6，其中通過交叉反應(yīng)非特異性結(jié)合檢測到比正確條帶更多的條帶。蛋白質(zhì)樣品在12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳跑樣，然后印跡到硝基纖維素膜上。蛋白質(zhì)樣本中的細(xì)胞角蛋白的westen blotting檢測方法采用改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)流程?？辜?xì)胞角蛋白抗體用LowCross Buffer® 或 TTBS（Tween- Tris緩沖鹽水）按照1：2500比例稀釋，用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測（二抗用LowCross緩沖液®或TTBS 按照1：1250比例進(jìn)行稀釋），再加入底物BCIP/NBT顯色。如果沒有LowCross Buffer®的幫助， 很難揭示非特異性結(jié)合反應(yīng)的確切分子原因。由于其他細(xì)胞角蛋白及其裂解產(chǎn)物或與肝臟或HeLa細(xì)胞的細(xì)胞破裂產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合，可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)發(fā)生。用LowCross buffer®替換TTBS，稀釋一抗和二抗，可以將非必要的結(jié)合減少，細(xì)胞角蛋白只在56 -60kDa的正確分子量區(qū)域內(nèi)被染色。

圖3: Western blotting法檢測細(xì)胞角蛋白4、5和6。圖中顯示了實(shí)驗(yàn)中使用LowCross Buffer®和TTBS檢測的效果對比。LowCross Buffer® 可以完全防止不必要的結(jié)合。細(xì)胞角蛋白4、5和6在56-60kDa之間，使用LowCross Buffer® 可清晰地被檢測到。泳道1和1'樣本來自肝細(xì)胞，泳道2和2'樣本來自Hela細(xì)胞。M為分子量marker，用酰胺黑染色。印跡膜是硝酸纖維素膜porablot NCP。

圖4 顯示了基質(zhì)效應(yīng)如何影響ELISA。通過這種模型分析（由Candor Bioscience公司開發(fā)），系統(tǒng)地誘導(dǎo)了基質(zhì)效應(yīng)。用兔血清作為基質(zhì)，加入一定濃度的C反應(yīng)蛋白。使用捕獲抗體(clone C2,1 µg/ml))和生物素化檢測抗體（clone C6, 2 µg/ml）。加入的血清樣品分別用PBS-BSA緩沖液或LowCross-Buffer®按照1：2進(jìn)行稀釋，用ELISA檢測。通過加入辣根過氧化物酶結(jié)合物及TMB底物進(jìn)行檢測。

圖4:ELISA法檢測家兔血清中的CRP。 LowCross-Buffer®通過去除基質(zhì)效應(yīng)來提高靈敏度。

基質(zhì)效應(yīng)的確切分子基質(zhì)未知，它會(huì)導(dǎo)致校準(zhǔn)曲線的靈敏度變差。CRP蛋白由于其生理特征，能夠結(jié)合許多蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)，可能顯著降低表位的可用性。雖然不能排除圖1(I-L)中所示的干擾效應(yīng)發(fā)生的可能，但大概率會(huì)發(fā)生圖1(L)所示的干擾效應(yīng)。LowCross Buffer®可防止CRP與兔血清內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合，從而將校準(zhǔn)曲線的靈敏度提高3倍。

圖5是用于豚鼠免疫毒理學(xué)研究的抗豚鼠免疫球蛋白的ELISA示例。在本試驗(yàn)中，特異性對照（A1-A12行）和空白值（H1-H12）的假陽性結(jié)合破壞了數(shù)據(jù)評估。LowCross Buffer®的使用防止了假陽性信號，而且使B至G行1-6或B至G行7-12的濃度檢測成為可能。使用山羊抗豚鼠IgG F（ab'）2作為捕獲抗體，并使用生物素化的山羊抗豚鼠IgG（Fcγ）作為檢測抗體。豚鼠IgG用LowCross Buffer®或PBS進(jìn)行稀釋。PBS-BSA緩沖液用作封閉緩沖液。用鏈霉親和素過氧化物酶和鄰苯二胺進(jìn)行檢測。

圖5: 在用豚鼠IgG進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)中，通過使用LowCross-Buffer®防止假陽性結(jié)合（A1- 12行為對照組，H1-12為空白組）。