間充質(zhì)干細胞(MSCs)由于其易于分離、多能性、免疫調(diào)節(jié)特性和可分泌支持組織重塑的介質(zhì)等特性，因此在基于細胞的組織工程和再生醫(yī)學方面具有巨大的治療潛力^[1,2]。MSCs和其他細胞一樣，釋放由細胞外囊泡(EVs)(凋亡小體、微囊泡和外泌體組成)，通過與細胞膜融合進行細胞間的通信^[3,4]。

外泌體是由核內(nèi)體衍生而來的小的納米級細胞外囊泡。它們是球形的，有一個脂質(zhì)雙層單膜，直徑在50-200納米之間。外泌體作為細胞間的信使，攜帶多種成分，包括反映其細胞來源的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物。這些成分維持著外泌體的潛在的治療功能，模仿它們來自的細胞，并有助于發(fā)展無細胞治療。此外，外泌體可以被設計為傳遞治療藥物的智能載體^[2,5,6]。

GeneDireX公司于2008年在美國成立，已經(jīng)在生物技術(shù)領(lǐng)域工作了10多年。由于我們的產(chǎn)品組合的擴大和生產(chǎn)重點的轉(zhuǎn)移，我們現(xiàn)在位于臺灣。我們的主要開發(fā)項目之一是細胞培養(yǎng)基。我們的細胞培養(yǎng)基是精心配制的，以支持多種細胞類型的生長和維持。我們提供各種基礎培養(yǎng)基、特殊培養(yǎng)基、補充劑和定制配方的高質(zhì)量材料和制造工藝，以滿足細胞培養(yǎng)需求的具體要求。在這里，我們提供了兩種不同的培養(yǎng)基，ADSC eXOrich和UCMSC eXOrich培養(yǎng)基，分別用于從人類脂肪來源的干細胞(ADSC)和臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(UCMSC)中生產(chǎn)外泌體。這種外泌體生產(chǎn)培養(yǎng)基是一種無血清和即用型的培養(yǎng)基。該成分可優(yōu)化提高外泌體的產(chǎn)量。

對于外泌體的純化，我們建議從細胞培養(yǎng)后準備條件培養(yǎng)基開始。從培養(yǎng)細胞中收集上清液，通過超高速離心或離心過濾去除大塊細胞碎片、細胞代謝產(chǎn)生的廢物以及培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。隨后，外泌體可以通過切向流過濾(TFF)進行濃縮，也可以通過體積排阻色譜(SEC)再次純化。通過納米顆粒跟蹤分析(NTA)確定了通過上述方法獲得的外泌體的直徑，并通過蛋白質(zhì)鑒定確定了外泌體的共同標記物的存在。

接下來，我們將分享我們在使用ADSC eXOrich和UCMSC eXOrich培養(yǎng)基生產(chǎn)外泌體方面的經(jīng)驗和結(jié)果。我們將使用NTA分析來確定顆粒的直徑和濃度，并使用流式細胞術(shù)(FCM)結(jié)合細胞膜染料FM4-64，來檢測和分析外泌體表面標記物： CD9、CD63和CD81。一般情況下，我們建議用戶用在原培養(yǎng)條件下培養(yǎng)MSCs至匯合度達90%，然后去除原培養(yǎng)基，用PBS和eXOrich培養(yǎng)基清洗細胞，去除殘留原培養(yǎng)基。然后用eXOrich培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞3-4天，收集上清液。我們通過使用0.22um的濾杯離心和過濾去除細胞碎片和大碎片或顆粒，并使用TFF-Easy(HansaBioMed)濃縮外泌體。

我們的結(jié)果顯示，使用α-MEM(圖1A)、IMDM(圖1B)和ADSC ADSC培養(yǎng)基(圖1C)培養(yǎng)獲得的常見外泌體粒徑分別為118.9±3.1、100.6±1.3和125.4±8.3。使用α-MEM、IMDM和ADSC eXOrich培養(yǎng)基的ADSCs分泌的外泌體(50-200 nm)的濃度(顆粒/mL)分別為6.63×10?±5.35×10?、7.37×10?±1.15×10?和2.11×10?±1.40×10?。ADSC eXOrich培養(yǎng)基比α-MEM或IMDM更能增加外泌體的產(chǎn)量(圖1D)。

圖1

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類似的實驗數(shù)據(jù)可以重復使用另一種培養(yǎng)基，UCMSC eXOrich培養(yǎng)基。使用α-MEM培養(yǎng)基的UCMSC分泌外泌體直徑為118.4±2.9 nm，外泌體濃度(50-200 nm)為2.22×10?±1.45×10?顆粒/mL(圖2A)。使用UCMSC eXOrich培養(yǎng)基的UCMSC分泌外泌體直徑為114.2±2.3 nm，濃度(50-200nm)為4.99×10?±2.85×10?顆粒/mL(圖2B)，高于α-MEM。

圖2

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此外，我們還使用流式細胞術(shù)分析了外泌體表面標記物： CD9、CD63和CD81的表達。實驗流程根據(jù)Pospichalova V等人的文章描述進行^[7]。我們利用參考珠：NanoFCM? Silica Nanospheres Cocktail #1，直徑從68到155納米，來設置光電倍增管的電壓和光散射的閾值(圖3A)。膜特異性、熒光兩親性苯乙烯基染料FM4-64被用于標記外泌體，因為外泌體具有脂質(zhì)雙層的單膜結(jié)構(gòu)。為了獲得更準確的數(shù)據(jù)，我們使用熒光減去一(FMO)對照來確定背景熒光和外泌體樣本中陽性群體產(chǎn)生的熒光之間的cut-off值。對使用ADSC eXOrich培養(yǎng)培養(yǎng)的ADSC分泌的外泌體進行FCM分析FCM分析結(jié)果顯示，在FM4-64染色后，一個升高的群體出現(xiàn)了熒光信號(圖3B)。對該群體進行設門，分析CD9、CD63和CD81的表達。在這里，我們給出了CD63與CD9(圖3C)和CD63與CD81的點圖分析結(jié)果(圖3D)。

圖3

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根據(jù)FCM分析數(shù)據(jù)，我們可以驗證使用ADSC eXOrich培養(yǎng)基產(chǎn)生的外泌體是否表達CD9、CD63和CD81。為了總結(jié)FCM分析結(jié)果，我們鑒定了一群至少直徑為68到155 nm的膜結(jié)構(gòu)的粒子。這些顆粒含有CD9、CD63和CD81，它們被認為是外泌體標記物。

總之，結(jié)合NTA數(shù)據(jù)與FCM分析結(jié)果，我們的eXOrich培養(yǎng)基是高效且有利于從MSC中產(chǎn)生外泌體的。

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相關(guān)產(chǎn)品

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產(chǎn)品貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
CC823-0500	ADSC eXOrich Medium	500 mL
CC824-0500	UCMSC eXOrich Medium	500 mL

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Q1.我們?nèi)绾萎a(chǎn)生外泌體？

答：對于外泌體的純化，我們建議在細胞培養(yǎng)后開始準備條件培養(yǎng)基。從培養(yǎng)細胞中收集上清液，通過超高速離心或離心過濾去除大塊細胞碎片、細胞代謝產(chǎn)生的廢物以及培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。隨后，外泌體可以通過切向流過濾（TFF）進行濃縮，也可以通過體積排阻色譜（SEC）再次純化。

Q2.我們?nèi)绾呜S富外泌體的生產(chǎn)？

答：外泌體被稱為細胞分泌的天然納米囊泡，在傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下，MSC-條件培養(yǎng)基產(chǎn)生的外泌體產(chǎn)量低，從而限制了其應用。最佳的細胞培養(yǎng)基可以增強MSC的外泌體分泌。因此，我們開發(fā)了兩種外泌體富集培養(yǎng)基。ADSC eXOrich培養(yǎng)基用于脂肪來源的干細胞分泌外泌體，UCMSC eXOrich培養(yǎng)基用于臍帶間充質(zhì)干細胞分泌外泌體。

Q3.需要這些補充劑嗎？

答：一般來說，常用的補充劑，如血清或人血小板裂解液，都含有外泌體。因此，我們不建議在制備外泌體分離的條件培養(yǎng)基時使用補充劑。當使用ADSC eXOrich或UCMSC eXOrich培養(yǎng)基生產(chǎn)外泌體時，不需要添加常見的營養(yǎng)補充劑，如血清或人血小板裂解液。然而，用戶可以根據(jù)自己的具體需要，決定添加適當?shù)臓I養(yǎng)補充劑。